sabato 20 aprile 2013

LA RICINA ED ALTRE TOSSINE VEGETALI CORRELATE

Articolo tratto da SCIENZA E TECNICA dell'Agosto 2005





Le piante hanno un ruolo importantissimo per l’esistenza e per la regolazione della vita
sulla terra eliminando l’anidride carbonica e producendo ossigeno. Sono indispensabili per la sopravvivenza dell’uomo, al quale forniscono il nutrimento, sia direttamente con i frutti, i semi, le
foglie, le radici, sia indirettamente, attraverso gli animali che di esse si nutrono. Inoltre, sono anche
fonte di materiali utili, come il legno, la paglia, le fibre, e producono una quantità di sostanze chimi-
che utili all’uomo, dai medicinali ai coloranti. Purtroppo, molte piante sono velenose, perché conten-
gono sostanze tossiche, alcune delle quali, a dosi opportune, sono usate in medicina, come la digitale
o il curaro. Molte sono ben note, l’aconito, la belladonna, la cicuta, altre sono meno conosciute. Fra
queste ultime, ve ne sono alcune che contengono delle tossine molto potenti. 

Semi di ricina
 
Due di queste, la ricina,dei semi di Ricinus communis, e l’abrina, dei semi di  Abrus precatorius, erano note dalla fine del XIX  secolo ed hanno anche importanza nella storia della scienza, perché contro di esse Paul Ehrlich preparò i primi anticorpi, ponendo le basi dell’immunità.

Pianta di Abrina

Queste tossine furono oggetto di pochissime altre ricerche finché, intorno al 1970, dei ricercatori
cinesi trovarono che erano maggiormente tossiche per alcune cellule tumorali, rispetto alle cellule normali.
Questa osservazione stimolò altri studi, e presto fu accertato che le due tossine hanno una simile strut
tura e simile meccanismo d’azione, consistente in un’attività enzimatica che danneggia irreversibil-
mente i ribosomi, provocando l’arresto delle sintesi proteiche e di conseguenza la morte delle cellule
(1). Le due tossine sono molto potenti, con una LD50 (dose che uccide il 50% degli animali) nell’ordine di microgrammi/kg di peso (per via intraperitoneale).
Negli anni ’80 nell’allora Istituto di Patologia generale, oggi Dipartimento di Patologia sperimentale, dell’Università di Bologna si cominciò a cercare se esistevano altre tossine simili, partendo dall’ipotesi che se due piante diverse fra loro come il ricino e l’abrus contenevano due tossine molto simili, forse altre tossine dello stesso tipo potevano essere presenti in altre piante velenose. Con paziente lavoro e con l’aiuto di molta fortuna, nel corso di pochi anni furono identificate la viscumina, del Viscum album (vischio) e due tossine delle radici di due Passifloracee africane, la modeccina dell’Adenia(Modecca) digitatae la volkensina, dell’Adeniavolkensii, ambedue più potenti della ricina.
Adenia digitata
Nel 2003 in Giappone è stata identificata un’altra tossina dello stesso tipo l’aralin, dell’Araliaelata,
una pianta che cresce in Giappone; la tossina è stata isolata dai germogli mangerecci, che sono consumati, evidentemente senza danni, probabilmente perché la tossina è ad un livello molto basso (circa 0.5 mg/100 grammi) ed è distrutta dalla cottura.
Infine, molto recentemente ancora nel Dipartimento di Patologia sperimentale di Bologna dalle radici di altre due Passifloracee africane sono state identificate e purificate altre due tossine, delle quali è in corso la caratterizzazione. Si è già accertato che sono fra le più potenti tossine vegetali conosciute:
la dose letale per il topo sembra essere nell’ordine di qualche microgrammo per kg di peso (per via
intraperitoneale); se per l’uomo fosse eguale, meno di un milligrammo somministrato per via parenterale ucciderebbe un uomo. La tossicità delle tossine è riassunta nella Tabella.
La ricina e le altre tossine simili ad essa sono costituite da due catene proteiche, una catena B che è una lectina, cioé una proteina capace di legarsi a zuccheri presenti sulla superficie delle cellule e permette così l’ingresso dell’altra catena, la A, che possiede l’attività enzimatica che provoca i danni ai ribosomi e forse ad altre strutture. Per questa loro struttura sono state chiamate proteine che inattivano i ribosomi (ribosome-inactivating proteins, RIP) di tipo 2, in contrapposizione alle RIP di tipo 1, costituite da una sola catena che ha la stessa attività della catena A delle tossine. Le RIP di tipo 1 sono state identificate, molte nel nostro Dipartimento, in molte piante, anche comuni ed eduli come, ad esempio, il garofano, la saponaria, gli spinaci; essendo sprovviste della catena B, non si legano alle cellule, nelle quali entrano con difficoltà e quindi sono molto meno tossiche delle RIP di tipo 2 (LD50 nell’ordine dei milligrammi/kg). Se però si riesce a farle entrare nelle cellule, sono tossiche quanto ed anche più della ricina.
Il meccanismo d’azione delle RIP è stato notevolmente chiarito, anche se forse non è ancora completamente noto. La prima indicazione venne dal lavoro dei ricercatori cinesi, che osservarono che la ricina e l’abrina inibivano la sintesi delle proteine. Successivamente dei ricercatori norvegesi accertarono che tale inibizione si aveva anche in un lisato di cellule, e nel nostro Istituto, soprattutto ad opera dei professori Lucio Montanaro e Simonetta Sperti si trovò che la ricina, e successivamente le altre RIP, danneggiavano irreversibilmente i ribosomi, gli organelli che sintetizzano le proteine (2). Dopo alcuni anni un ricercatore giapponese, Endo, fece un notevole passo avanti, accertando che la ricina danneggiava i ribosomi rimuovendo una sola base, l’adenina, in un punto preciso dell’RNA ribosomale (3). Nel 1997 il prof. Barbieri del nostro laboratorio osservò che tutte le RIP rimuovono adenina anche dal DNA ed alcune anche da altri polinucleotidi (4). Alcune osservazioni indicano che ciò potrebbe avvenire anche nelle cellule intere, e questo forse potrebbe spiegare come mai le RIP provocano lesioni differenti da quelle causate da altre sostanze che inibiscono la sintesi delle proteine. Le caratteristiche delle RIP sono riassunte in diverse rassegne recenti (5-7).
Le catene A delle tossine o le RIP di tipo 1 sono state legate a molecole vettrici capaci di legarsi a specifici bersagli cellulari, formando così coniugati, soprattutto con anticorpi (“immunotossine”) selettivamente tossici per le cellule bersaglio degli anticorpi o degli altri vettori usati (rassegna in 8).
Questi composti sono usati in ricerche sperimentali, ma sono stati sperimentati anche in prove cliniche per eliminare selettivamente determinati tipi di cellule dannose, soprattutto per la terapia dei tumori. I risultati ottenuti finora sono stati incoraggianti, nel senso che in diverse prove negli animali, ma anche nell’uomo, si è ottenuta una riduzione dei tumori, soprattutto ematologici (linfomi), con effetti collaterali tollerabili e spesso inferiori a quelli delle chemioterapie tradizionali. Purtroppo questi coniugati, essendo costituiti da proteine non umane, provocano nei pazienti una risposta immunitaria che ne impedisce la somministrazione ripetuta, e quindi allo stato attuale delle ricerche non sono utilizzabili in terapia. Potrebbero tuttavia essere usati in casi particolari, ad esempio per la terapia di tumori della vescica, che comporta l’applicazione locale e quindi “esterna” dei coniugati, con minori effetti tossici e immunogeni.
Le immunotossine sono anche utili strumenti di ricerca, ad esempio per eliminare in maniera selettiva un tipo di cellule in una cultura. Il maggiore sviluppo è stato l’uso di coniugati di saporina, una RIP di tipo 1 della saponaria, con anticorpi contro neuroni colinergici ed altri tipi di cellule nervose, con i quali sono stati compiuti numerosi studi di neurofisiologia, riassunti in un libro di recente pubblicazione (9).
Le RIP di tipo 1 hanno anche proprietà antivirali, e se ne è studiata la possibilità d’impiego anche in terapia umana, specialmente dell’infezione da HIV, purtroppo con scarso successo. Invece, hanno dato risultati più promettenti le ricerche sull’impiego di queste proteine contro i virus delle piante, ed in diversi casi si è osservato che piante nelle quali era stato inserito il gene di una RIP erano più resistenti alle infezioni virali (rassegne in 10, 11).

Tossine che inattivano i ribosomi
  
Tossina - Pianta d’origine - LD501(mg/kg)
Abrina - Abrus precatorius - 0.0028
Modeccina - Adenia (Modecca)digitata - 0.0053
Ricina - Ricinus communis - 0.0080
Viscumina - Viscum album - 0.0024
Volkensina - Adenia volkensii - 0.0017

1 Dose, in mg/kg, che somministrata per iniezione intraperitoneale uccide
metà degli animali (topi) entro 48 ore.

 Purtroppo le tossine possono essere usate anche per fini criminali; è ben noto il delitto ricordato come “omicidio con l’ombrello”: nel 1978 Georgi Markov, un giornalista bulgaro dissidente, fu ucciso a Londra con un piccolo proiettile con una cavità di circa un millimetro cubo, sparato da un’arma nascosta in un ombrello. In base alle lesioni riscontrate all’autopsia, fu diagnosticato un avvelenamento da ricina, evidentemente contenuta nella piccola cavità del proiettile.
La ricina è considerata come possibile arma biologica (esiste addirittura un brevetto intitolato
“Toxic ricin for warfare”) in eventi bellici ed anche di bioterrorismo (12). In effetti, potrebbe essere
l’arma biologica preferita soprattutto da gruppi terroristici con un minimo di organizzazione, a causa
della facilità di reperimento del materiale di partenza (semi di ricino) e della semplicità di preparazione, per la quale sarebbero sufficienti poche attrezzature.
La ricina e le tossine simili sono proteine e quindi sono facilmente degradabili; inoltre, se somministrate per via orale la loro tossicità è molto inferiore rispetto a quella che si ha per iniezione endovenosa o intraperitoneale, mentre è elevata se sono inalate. Sarebbe quindi poco efficace, e di conseguenza sembra improbabile, un attentato mediante immissione di una di queste tossine in un acquedotto, anche perché sarebbe necessaria una gran quantità di tossina, e sarebbe anche poco praticabile un avvelenamento attraverso la catena alimentare.
Sarebbe invece temibile un avvelenamento, anche di molte persone, mediante diffusione della tossina
nell’atmosfera in forma di polvere o come aerosol, specialmente in un locale chiuso, come un teatro,
una chiesa, un’aula, forse anche uno stadio. Questa possibilità ha stimolato diverse ricerche sulla tossicità della ricina ed altri agenti tossici per via inalatoria (13), ed allo sviluppo di anticorpi e soprattutto vaccini per la prevenzione degli effetti tossici (14). Fra tutte le tossine che inattivano i ribosomi, la ricina potrebbe essere la sola utilizzabile da persone o gruppi con disponibilità limitate, come i terroristi isolati, poiché le altre si trovano in piante difficilmente reperibili in grandi quantità. Tuttavia, un esercito o altra grande organizzazione provvista di ampi mezzi potrebbe utilizzare anche le altre tossine, poiché si potrebbero clonare i loro geni ed ottenere quantità illimitate di tossina sfruttando le tecniche dell’ingegneria genetica. Inoltre, non è difficile immaginare la possibilità di manipolare le tossine o i loro geni con varie tecniche biotecnologiche per impieghi delittuosi, bellici o terroristici, con possibilità di conseguenze anche catastrofiche.
Senza arrivare a questi estremi, le piante che contengono queste tossine, alcune in quantità rilevanti, possono essere adoperate a scopi delittuosi anche senza la necessità di estrarre e purificare le tossine; inoltre, potrebbero essere fonte di pericolosi incidenti, ad esempio se fossero facilmente raggiungibili da bambini. Queste piante, alcune delle quali sono ricercate dai collezionisti, sono in libera vendita in Italia o in nazioni della Comunità Europea, dalle quali possono essere importate senza restrizioni. Sarebbe difficile proibire la vendita delle piante velenose, ma forse si potrebbe introdurre, con una normativa semplice, almeno l’obbligo di un’etichetta per segnalare la tossicità per le piante conosciute come velenose e suggerire cautela per le piante della cui innocuità non si è certi.
Chi scrive non ha la competenza necessaria per indicare misure atte a prevenire l’impiego delle tossine a fini bellici o terroristici. Ritiene tuttavia che sarebbe utile

a) conoscere ed avere una lista di ricercatori esperti in materia, ai quali si potrebbe fare riferimento in caso di necessità;
 b) facilitare le ricerche sull’argomento, favorendone il finanziamento e semplificando gli adempimenti burocratici connessi alla detenzione di tossine, almeno per le piccole quantità necessarie a scopi di ricerca;
 c) avere prontamente disponibile metodi sensibili per la rilevazione rapida di tracce di tossine, almeno per la ricina.

 Fiorenzo Stirpe
 Dipartimento di Patologia sperimentale dell’università di Bologna
  
BIBLIOGRAFIA

1. OLSNES,S. The history of ricin, abrin and related toxins, Toxicon 44, 361-370, 2004.
2. MONTANARO, L., SPERTI,S.,STIRPE, F. Inhibition by ricin of protein synthesis in vitro. Ribosomes as the target of the toxin, Biochem. J. 136, 677-683, 1973.
3. ENDO,Y.,TSURUGI,K RNA N-glycosidase activity of ricin A-chain. Mechanism of action of the toxic lectin ricin on eukaryotic ribosomes, J. Biol. Chem. 262, 8128-8130, 1987.
4. BARBIERI, L., VALBONESI,P.,BONORA, E., GORINI,P., BOLOGNESI, A., STIRPE,F. Polynucleotide:adenosine glycosidase activity of  ribosome-inactivating proteins:effect on DNA, RNA and poly(A),Nucleic Acids Res. 25,518-522, 1997.
5. VAN DAMME, E.J.M., HAO,Q.,BARRE, A., VANDEN-BUSSCHE ,F.,DESMYTER,S.,ROUGÉ,P.,PEUMANS, W.J.Ribosome-inactivating proteins: a family of plant proteins that do more than inactivate ribosomes, Crit. Rev.Plant Sci. 20, 395-465, 2001.
6. GIRBÉS,T.,FERRERAS, J.M., ARIAS, F.J., STIRPE,F.Description, distribution, activity and phylogenetic relationship of ribosome-inactivating proteins in plants, fungi and bacteria,Mini Rev. Med. Chem. 4, 461-476,2004.
7. STIRPE,F. Ribosome-inactivating proteins , Toxicon44, 371-383, 2004.
8. FRACASSO,G.,BELLISOLA,G.,CASTELLETTI,D.,TRIDENTE,G.,COLOMBATTI,M. Immunotoxins and other conjugates:
Preparation and general characteristics,Mini Rev. Med.Chem. 4, 545-561, 2004.
9. WILEY, R.G., LAPPI, D.A. Molecular Neurosurgery with Targeted Toxins, Humana Press, Totowa, NJ, 2005.
10. WANG,P.,TUMER, N.E. Virus resistance mediated byribosome inactivating proteins , Adv. Virus Res. 55, 325-355, 2000.
11. PARIKH; B.A., TUMER, N.E. Antiviral activity of ribosome inactivating proteins in medicine, Mini Rev.Med.Chem. 4, 523-543, 2004.
12. ELLISON, D.H.Handbook of Chemical and Biological Warfare Agents, pp. 184-191, CRC Press, New York,1999.
13. GRIFFITHS, G.D., RICE,P.,ALLENBY, A.C., BAILEY,S.C., UPSHALL, D.G. Inhalation toxicology and histopathology of ricin and abrin toxins, Inhal. Toxicol.7, 269-288, 1995.
14. PADDLE, B.M. Therapy and prophylaxis of inhaled biological toxins, J. Appl. Toxicol. 23, 139-170, 2003.